Pubblicato dall’Istituto Superiore di Sanità, il documento descrive le Procedure Operative per la Determinazione delle Sostanze d’Abuso nel Sangue, elaborate da esperti italiani presso l’Istituto Superiore di Sanità.

Questo testo stabilisce protocolli standardizzati a livello nazionale per i laboratori di farmaco-tossicologia, coprendo l’intero processo dalla raccolta del campione (incluse la catena di custodia e il consenso informato) fino alla consegna dei risultati analitici.

Le procedure dettagliate includono le metodologie per le analisi di screening e di conferma—tipicamente tramite spettrometria di massa—sottolineando l’importanza di accuratezza, precisione e cut-off stabiliti, specialmente in contesti medico-legali come quelli legati al Codice della Strada. Inoltre, il documento affronta l’assicurazione e il controllo di qualità delle analisi e i requisiti per la validazione dei metodi di laboratorio.

L’obiettivo principale è armonizzare le pratiche per garantire risultati affidabili e legalmente difendibili, essenziali per la valutazione dello stato psicofisico di un soggetto.

Il testo (file PDF) affronta anche la controversa questione dei cut-off (valori soglia) per le sostanze nel sangue, citando riferimenti internazionali e italiani, e stabilisce le norme per la consegna dei risultati e l’assicurazione della qualità delle analisi.

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Sintesi

L’analisi tossicologica del sangue: Cut-off, Conferma e Catena di Custodia

Introduzione: perché analizzare il sangue?

Quando si deve dimostrare che una persona ha consumato una sostanza stupefacente in un momento preciso, il sangue è la matrice che rappresenta l’attualità d’uso , cioè permette di stabilire o escludere un’assunzione recente recente.

A differenza di altri campioni, la concentrazione di una sostanza nel sangue è direttamente collegabile allo stato psicofisico del soggetto al momento del prelievo.

Questo lo rende un elemento di prova cruciale in contesti critici come la guida di veicoli, dove è fondamentale accertare una persona sta guidando sotto l’influenza di alcol o dopo aver assunto sostanze stupefacenti o psicotrope.

Nonostante la sua importanza, in Italia mancano ancora decreti attuativi specifici che stabiliscano modalità di prelievo e valori soglia (cut-off) universalmente validi.

Questa necessità di chiarezza è resa ancora più urgente dall’introduzione del reato di omicidio stradale (art. 589 bis c.p.), che inasprisce le pene e richiede accertamenti tossicologici legalmente inattaccabili.

Per garantire che un risultato sia affidabile e legalmente valido, il campione di sangue deve seguire un percorso rigoroso e tracciabile fin dal primo istante, un processo noto come “Catena di Custodia” (inserire anche in questo caso la modulistica necessaria verbale di prelievo , consenso informato e la catana di custodia).

1. Il Viaggio del Campione: La Catena di Custodia

Per assicurare che il campione analizzato in laboratorio sia esattamente lo stesso prelevato ore prima, e che non sia stato alterato, esiste un protocollo ferreo: la catena di custodia. Possiamo immaginarla come il “passaporto” del campione, che ne garantisce l’integrità e la tracciabilità in ogni fase.

1.1 Cos’è la Catena di Custodia?

La catena di custodia è un processo documentato che tiene traccia del controllo e della movimentazione del campione biologico, dal momento del prelievo fino al suo smaltimento finale. Ogni passaggio viene registrato su un apposito modulo, che segue il campione come un’ombra. Gli elementi chiave tracciati sono:

Chi: Il nome e la firma di ogni persona che ha maneggiato, trasportato o analizzato il campione.
Dove: Il luogo esatto del prelievo e il laboratorio di destinazione.
Quando: La data e l’ora precisa di ogni passaggio di mano, dal prelievo all’arrivo in laboratorio.
Cosa: Le informazioni univoche che identificano il campione, come un codice a barre o alfanumerico, per evitare qualsiasi possibilità di scambio.

1.2 Perché è Fondamentale?

La catena di custodia è la spina dorsale di qualsiasi analisi con valore legale. Il suo scopo è garantire che il risultato finale sia “legalmente difendibile”, escludendo ogni ragionevole dubbio su possibili manomissioni, contaminazioni o falsificazioni del campione.

Un’irregolarità in questo processo, come un sigillo antimanomissione rotto o un modulo compilato in modo incompleto, ha conseguenze drastiche. Il laboratorio non può procedere con le analisi e il campione viene rigettato, perdendo ogni validità. In questi casi, il laboratorio è tenuto a redigere un apposito “verbale di non conformità” e a notificare l’irregolarità all’ente richiedente.

Una volta che il campione, protetto dalla sua catena di custodia, arriva intatto in laboratorio, inizia il processo di analisi vero e proprio, che si svolge in due fasi distinte ma complementari.

2. Dentro il laboratorio: il processo di verifica a due fasi

Per identificare una sostanza d’abuso con certezza scientifica e legale, non basta un solo test. Il laboratorio segue un approccio a due livelli, che combina velocità e precisione.

2.1 Fase 1: L’Analisi di Screening (La Rete a Maglie Larghe)

Il primo passo è un’analisi di screening. Questo test può essere descritto come una “rete a maglie larghe”: è rapido, molto sensibile e progettato per catturare la possibile presenza di intere classi di sostanze (es. oppiacei, cannabinoidi).

Tuttavia, ha una bassa specificità, il che significa che non può identificare con certezza la singola molecola. Il risultato di questo test è puramente qualitativo: indica una “probabile positività” (o, più correttamente, una “non negatività”), ma non fornisce una concentrazione esatta.

Il punto più importante da ricordare è questo: un risultato positivo al solo test di screening è privo di qualsiasi valore medico-legale.

2.2 Fase 2: L’Analisi di Conferma (La Prova Definitiva)

Se lo screening risulta “non negativo”, scatta l’obbligo di procedere con la seconda fase: l’analisi di conferma. Questo è il test che fornisce la prova definitiva. Utilizza tecniche analitiche estremamente sofisticate e specifiche, come la cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa, che permettono di:

Identificare con certezza la struttura chimica esatta della sostanza presente.
Quantificarla accuratamente, determinandone la concentrazione precisa nel sangue.

La tabella seguente riassume le differenze fondamentali tra i due approcci:

Caratteristica	Analisi di Screening	Analisi di Conferma
Scopo	Identificare una possibile presenza (test preliminare)	Identificare con certezza e quantificare la sostanza
Specificità	Bassa (rileva classi di sostanze, non la singola molecola)	Alta (identifica la struttura chimica esatta)
Valore Legale	Nullo se positivo	Pieno valore legale
Risultato	Qualitativo (“non negativo”)	Quantitativo (concentrazione esatta)

Ora che sappiamo come un laboratorio conferma la presenza di una sostanza, sorge una domanda fondamentale: quale concentrazione è sufficiente per considerare un campione “positivo”? Questo ci porta al concetto di cut-off.

3. La Soglia di Positività: Comprendere il “Cut-off”

Anche se una sostanza è presente, non significa automaticamente che il campione sia dichiarato “positivo”. Per prendere questa decisione in modo oggettivo e standardizzato, i laboratori utilizzano un valore di riferimento chiamato cut-off.

3.1 Che Cos’è un Cut-off?

Un cut-off è un limite di concentrazione, stabilito per convenzione scientifica, che funge da soglia per distinguere un campione “positivo” da uno “negativo”.

Se la concentrazione della sostanza misurata nell’analisi di conferma è uguale o superiore al valore di cut-off, il campione è refertato come positivo.
Se la concentrazione è inferiore al cut-off, anche se la sostanza è presente in tracce, il campione viene refertato come negativo.

3.2 Perché la Definizione del Cut-off è Complessa?

La scelta di un valore di cut-off non è arbitraria, ma deve avere una solida base scientifica. La situazione è particolarmente complessa perché:

Mancanza di una legge nazionale: In Italia non esistono, al momento, valori di cut-off stabiliti per legge per il sangue che definiscano l'”alterazione psico-fisica” ai fini della guida.
Evoluzione del concetto: Il Gruppo dei Tossicologi Forensi Italiani (GTFI) ha evoluto il concetto, passando dal semplice “cut-off” ai “requisiti minimi di prestazione”. Questo non è un semplice cambio di nome, ma una risposta a un problema scientifico cruciale. L’obiettivo non è inseguire tracce sempre più piccole di una sostanza, ma garantire che il dato sia legalmente inattaccabile. È scientificamente provato, infatti, che le concentrazioni vicine al limite di quantificazione di uno strumento vengono misurate con maggiore imprecisione e inaccuratezza. Un dato così incerto non è compatibile con la richiesta di un risultato inequivocabile a fini medico-legali. Pertanto, si richiede che il laboratorio dimostri di poter quantificare con la massima affidabilità almeno una certa concentrazione, garantendo un dato solido e difendibile. Avere processi rigorosi e soglie definite non basta. Per essere certi dell’affidabilità di ogni singolo risultato, il laboratorio deve dimostrare che i metodi di analisi che utilizza sono scientificamente validi e funzionano sempre allo stesso modo.

4. La Garanzia di Affidabilità: La Validazione del Metodo

Prima che un laboratorio possa utilizzare una tecnica analitica per produrre risultati con valore legale, deve sottoporla a un rigoroso processo di controllo chiamato “validazione”.

4.1 Cos’è la Validazione di un Metodo?

La validazione è l’insieme di procedure sperimentali che dimostrano che un metodo di analisi è affidabile, riproducibile e adatto allo scopo per cui viene utilizzato. È la prova scientifica che quella specifica procedura funziona come dovrebbe.

Possiamo pensare alla validazione usando l’analogia di una ricetta di cucina professionale: è il processo con cui uno chef dimostra che, seguendo esattamente quella ricetta (stessi ingredienti, stesse dosi, stessi tempi), si otterrà sempre e comunque lo stesso piatto perfetto, indipendentemente da chi lo cucini.

4.2 I Pilastri della Validazione: i parametri più importanti valutati durante la validazione sono:

Esattezza (Centrare il Bersaglio): È la capacità del metodo di trovare il valore “vero”. Se in un campione ci sono 10 ng/ml di una sostanza, un metodo accurato misurerà un valore molto vicino a 10. Corrisponde a colpire il centro del bersaglio.
Precisione (Raggruppare i Colpi): È la capacità del metodo di dare sempre lo stesso risultato se si ripete l’analisi sullo stesso campione. Un metodo preciso, ma non accurato, potrebbe dare risultati molto vicini tra loro (es. 12.0, 12.1, 11.9 ng/ml), quando il valore vero è 10. Corrisponde a raggruppare tutti i colpi in un punto molto piccolo, ma lontano dal centro.
Limite di rilevabilità o di sensibilità (LOD) rappresenta la più piccola quantità di analita presente in un campione che può essere rilevata, ma non quantificata, con una data probabilità .
Limite di quantificazione (LOQ) che rappresenta la più piccola quantità di analita che può essere quantificata con una data imprecisione.
Linearità del metodo cioè la sua capacità di dare risultati analitici che sono direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita studiato.
Effetto matrice parametro che stabilisce un’alterazione della risposta dell’analita dovuta a interferenze di componenti non identificati all’interno di una matrice biologica. Per ogni singola matrice l’accuratezza deve essere entro ±15% della concentrazione nominale e la precisione (%CV) non deve essere superiore al 15%.
Effetto trascinamento o carry-over rappresenta è un’alterazione della concentrazione dell’analita in un campione dovuta al residuo dell’analita precedentemente analizzato e rimasto nello strumento analitico. Il carry-over dovrebbe essere valutato analizzando i campioni bianchi dopo lo standard di calibrazione; il valore di carry-over nel bianco dopo un campione ad alta concentrazione di analita non deve essere maggiore del 20% del LOQ e del 5% per l’IS. Dunque se l’analisi di tale bianco produce un risultato inferiore al limite di identificazione, LOD, il carry-over del metodo è accettabile.
Recupero rappresenta un valore fondamentale per valutare l’efficienza di una procedura di estrazione del campione. Il recupero dell’analita non deve essere necessariamente al 100%, i criteri di accettazione sono soddisfatti quando i risultati sono tra 90-110%.
Stabilità: misura la suscettibilità dell’analita a fenomeni degradativi-idrolitici di natura biotica (nel campione biologico, successivamente al prelievo) e/o abiotica (esposizione a luce, calore, pH, cicli di congelamento/scongelamento). A tal riguardo dovrebbero essere effettuate valutazioni di stabilità per garantire che ogni passo intrapreso durante la preparazione del campione, la lavorazione e l’analisi nonché le condizioni di conservazione utilizzate non influiscono sulla concentrazione dell’analita.
Test della integrità della diluizione tale valutazione è fondamentale poiché può essere necessario diluire il campione e la diluizione deve essere una parte di un metodo validato; in questo caso l’inaccuratezza e il bias che ne derivano devono essere al di sotto del 15%. La valutazione della integrità della diluizione deve dunque far parte della validazione parziale del metodo.

L’obiettivo della validazione è garantire che il metodo sia accurato e preciso.

Conclusione: un processo a garanzia di tutti

Dall’arrivo del campione in laboratorio fino alla consegna del referto, il processo di analisi tossicologica del sangue si basa su quattro pilastri fondamentali:

Catena di Custodia: Garantisce l’integrità e la tracciabilità del campione.
Screening e Conferma: Assicura che solo i risultati certi e quantificati abbiano valore.
Cut-off e Requisiti di Prestazione: Fornisce criteri oggettivi per definire un risultato positivo.
Validazione del Metodo: Certifica che le tecniche usate sono scientificamente affidabili.

Il rigore di queste procedure non è un eccesso di burocrazia, ma un sistema di garanzie essenziali.

Questo approccio scientifico e meticoloso è indispensabile per produrre un risultato legalmente inattaccabile, proteggendo sia la collettività da rischi come la guida sotto effetto di stupefacenti, sia i diritti della persona sottoposta all’analisi.

Procedure operative per la determinazione delle sostanze d’abuso su sangue